Badania genetyczne


Badania genetyczne przy Zespole Marfana

Technika MLPA: między cytogenetyką, a biologią molekularną

Nazywana potocznie „małpą” technika MLPA (ang. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) nie jest ani tak znana jak SSCP, ani tak popularna jak RFLP, ani tak sławna jak FISH. Jest za to równie elastyczna jak wszystkie wymienione metody razem wzięte i pozwala na detekcję małych i większych mutacji, jak również rearanżację chromosomowych naraz. Ani rutynowa cytogenetyka ani tradycyjna diagnostyka molekularna nie oferuje tak szybkiego i zgrabnego screeningu jak MLPA, a mimo to nie jest to powszechnie stosowana w diagnostyce metoda. Może jednak warto przyjrzeć się jej bliżej?

MLPA powstała jako odpowiedź na pytanie: czy da się podczas jednej reakcji PCR zamplifikować więcej niż 10 amplikonów? Każdy, kto choć raz łączył PCR’y w multipleks wie, że przy tradycyjnym podejściu do zagadnienia jest to praktycznie niewykonalne. Ale jest sposób, który eliminuje konieczność mieszania >20 oligonukleotydowych starterów, by zamplifikować interesujące nas geny. Wystarczy użyć uniwersalnych adaptorów przed właściwą reakcją PCR. Dzięki temu jeden komplet starterów komplementarnych do sekwencji adaptorów zamplifikuje co nam się żywnie podoba!

Mechanizm reakcji

W MLPA wykorzystano dwie znane od dawna techniki, należące do kanonu biologii molekularnej: PCR oraz ligację DNA. Pierwszy etap reakcji polega na hy6brydyzacji sond połówkowych, częściowo komplementarnych do sekwencji docelowych naszego DNA, częściowo zaś niekomplementarnych. Obie połówki sond hybrydyzują dokładnie obok siebie na DNA, pozwalając na późniejszą ligację, natomiast sekwencje niekomplementarne zawierająna końcu tag wspólny dla wszystkich połówek (który stanie się po ligacji sekwencją przyłączającą starter) oraz tak zwany stuffer, niekomplementarny ciąg zasad DNA, którego jedyną funkcją jest wydłużenie sekwencji amplifikowanej później przez wspólne startery. Celem jest to, żeby każda sonda różniła się znacząco wielkością. Pozwoli to na rozdział elektroforetyczny zaplifikowanych sond. Po przyłączeniu sond połówkowych następuje ligacja obu połówek każdej z sond. Produktem ligacji jest zestaw sond o różnej sekwencji środka, różnej długości, ale o wspólnych sekwencjach końców.

Nasz zestaw sond jest później poddawany amplifikacji w reakcji PCR, wykorzystującej pojedynczą parę starterów, komplementarną do sekwencji brzeżnych sond. Produkty amplifikacji rozdziela się z reguły kapilarnie, chociaż niektóre metodyki dopuszczają rozdział agarozowy (na przykład w screeningu mutacji dystrofiny, tak zwanym low-resolution MLPA). Żeby pomóc wam zrozumieć nietypowy i dość zawiły mechanizm reakcji zamieszczam poniżej rycinę, obrazującą przebieg MLPA.

Niezbędne odczynniki i sprzęt

MLPA nie wymaga bardzo zaawansowanego sprzętu, a odczynniki niezbędne do przeprowadzenia analizy (ligaza, bufor, sondy i startery, polimeraza i dNTP) są sprzedawane w zestawie przez laboratorium, w którym wynaleziono i udoskonalono technikę i to za stosunkowo niewielkie pieniądze. Do wszystkich analiz wymagany jest termocykler (nie ma chyba laboratorium molekularnego, które nie byłoby wyposażone w to urządzenie) a dodatkowo, do oznaczeń o wysokiej rozdzielczości, konieczny jest system do fluorescencyjnej elektroforezy kapilarnej. Brak tego kosztownego sprzętu nie stanowi jednak problemu nie do przeskoczenia dla małych laboratoriów — rozdział kapilarny wykonywany jest przez wiele firm i nie jest drogi (koszt poniżej 20 złotych za próbkę), więc technika MLPA jest osiągalna niemal dla każdego.

Samodzielne przygotowanie testu w oparciu o MLPA?

MRC Holland oferuje obecnie duży wybór zestawów do MLPA, które pokrywają większość zapotrzebowania dla diagnostyki i badań naukowych. Każdego naukowca kusi jednak perspektywa przygotowania własnego, skrojonego na miarę MLPA. Z jednej strony jest to bardzo atrakcyjna technika o wielkim potencjale, z drugiej jednak stanowi ogromne wyzwanie dla bioinformatyków i spory koszt poniesiony na przygotowanie sond połówkowych (amplifikacja w oparciu o wektory fagowe M13). W Polsce niewiele laboratoriów na to stać, a ryzyko, że metoda nie będzie chodzić, albo że połowa sond „wypadnie” z powodu konfliktów sterycznych i dimeryzacji jest znaczne. Nie oznacza to jednak, że nie warto podnieść rękawicy; należy jednak zastanowić się i przekalkulować, czy projektowanie własnego zestawu MLPA nam się opłaci.

Nie tylko zalety

Oprócz trudności w przygotowaniu własnej metodyki MLPA metoda ma inne wady, które zmniejszają jej użyteczność. Przede wszystkim MLPA rzadko wykrywa translokacje zrównoważone, nie nadaje się także do poszukiwania nieznanych mutacji. Wrażliwość na SNP w miejscu ligacji jest przydatna w analizie znanych mutacji, ale jest też piętą achillesową, bo obecność polimorfizmów pomiędzy sondami połówkowymi może być potraktowana jako (fałszywie) pozytywny wynik. Inny potencjalny problem to czystość DNA poddanego hybrydyzacji z sondami MLPA. Materiał musi być nienagannej jakości, by można było przeprowadzić reakcję.

Dla cytogenetyków złą wiadomością będzie także ograniczenie możliwości identyfikacji rearanżacji chromosomowych do populacji komórek. Nie jesteśmy w stanie określić kariotypów poszczególnych komórek — wynik jest wypadkową wszystkich rearanżacji w pewnej ich populacji, więc nie mamy możliwości opisu materiału z taką dokładnością, z jaką ma to miejsce w cytogenetyce klasycznej.

Zastosowania metody

Gdzie MLPA ma zastosowanie? Metoda przeżywa swój renesans w diagnostyce prenatalnej i genetyce klinicznej, wspomagając analizę kariotypu i FISH w poszukiwaniu zespołów mikrodelecyjnych i insercji, które są nieuchwytne w badaniu chromosomów metafazalnych. Wiele metodyk jest także dedykowanych badaniom aberracji chromosomowych w onkologii i hematologii (istnieją panele dedykowane np. dla chłoniaków czy ostrych białaczek) oraz mutacji kojarzonych z wieloma zaburzeniami (EGFR w niedrobnokomórkowym raku płuca, BRCA1 i 2 w raku piersi). MLPA jest także w stanie zidentyfikować disomię jednorodzicielską (analiza profilu metylacji) jako przyczynę choroby oraz dać odpowiedź (w niektórych przypadkach) na pytanie o to dlaczego pary starające się o potomstwo nie mogą go począć.

Wiele laboratoriów w Polsce ma już w swojej ofercie MLPA. Mimo pewnych słabości, ta metoda ma przyszłość ze względu na swoją prostotę i wyjątkową plastyczność. Na pewno warto rozważyć wypróbowanie jej w praktyce.

Marzena Pieronkiewicz

Żródło: http://dolinabiotechnologiczna.pl/

Google Translate  ||  Zmień wielkość tekstu na witrynie  |  Zmień kontrast wyświetlania witryny

Google Plus - Stowarzyszenie Marfan Polska
Facebook - Grupa Forum Marfan Polska